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Schema della rete neurale, in grado di rimuovere il contributo spurio dagli spettri CARS e restituire lo spettro pulito.

Nell’ambito della microscopia vibrazionale non-lineare, ogni pixel di un’immagine consta di una serie di valori, collettivamente chiamati spettro. I valori dello spettro sono correlati con la concentrazione di specie chimiche nella porzione di spazio identificata dal pixel. Uno dei problemi nell’ambito della microscopia vibrazionale CARS (Coherent Anti-Stokes Raman Scattering), che tra le complesse tecniche non-lineari è una delle più promettenti, è la presenza di un segnale spurio, che si somma a quello fisicamente rilevante, e distorce e degrada lo spettro, impedendo una corretta quantificazione e identificazione dei legami chimici.

Nel lavoro di Valensise, Giuseppi, Vernuccio, De la Cadena, Cerullo e Polli, “Removing non-resonant background from CARS spectra via deep learning, pubblicato sulla prestigiosa rivista APL photonics (https://doi.org/10.1063/5.0007821) il deep learning, una delle tecniche più impiegate di intelligenza artificiale, è impiegato per rimuovere il contributo spurio dagli spettri CARS, misurati in laboratorio al Politecnico di Milano, sfruttando un setup interamente sviluppato dal gruppo di ricerca del Prof. Polli. In figura è rappresentato il concetto dell’articolo. Lo spettro misurato viene processato da una rete neurale convoluzionaria opportunamente allenata a restituire lo spettro pulito dai segnali spuri.

Rispetto alle tecniche tradizionali, il filtraggio del rumore basato sul deep learning promette tempi di processamento più veloci e maggiore versatilità, oltre ad una potenziale applicazione in tempo reale, per ricostruire immagini chimiche quantitativamente affidabili immediatamente dopo che esse siano acquisite.

Questo risultato, ottenuto grazie ai finanziamenti del progetto NEWMED, costituisce un importante milestone per il raggiungimento dell’obiettivo 1: “Sviluppo di microscopi Raman per istopatologia intraoperatoria di lesioni tumorali”

Adipogenesi e condrogenesi delle cellule staminali. Nella prima riga: a sinistra, il saggio colorimetrico con oil red-O di cellule fissate ha mostrato la formazione di goccioline lipidiche in rosso; al centro, immagine in modalità CARS dello stesso campione; a destra, un rendering volumetrico 3D del segnale CARS acquisito. Nella seconda riga: a sinistra, i dosaggi del blu di toluidina eseguiti su campioni fissi rivelano la produzione di componente acida dell'ECM colorato in blu. Al centro, imaging CARS del collagene in campioni non trattati, vivi e differenziati; a destra, immagine in modalità generazione di seconda armonica (SHG) acquisita su cellule staminali vitali dopo 21 giorni di differenziazione, in grado di visualizzare fibrille di collagene (frecce bianche).

L’osservazione in tempo reale ed in modalità non invasiva di campioni biologici vitali è una delle tematiche centrali della microscopia. La microscopia multi-fotone permette di studiare i meccanismi alla base di diverse funzioni cellulari, combinando diverse modalità tra loro come, la fluorescenza a due fotoni (TPEF), la generazione di seconda e terza armonica (SHG-THG) e la microscopia Raman coerente (CARS ed SRS), in assenza di marcatori esogeni. In un lavoro recentemente pubblicato sulla rivista internazionale “Frontiers in Bioengineering and Biotechnology” (V. Parodi, E. Jacchetti, R. Osellame, G. Cerullo, D. Polli and M.T. Raimondi, “Nonlinear Optical Microscopy: From Fundamentals to Applications in Live Bioimaging”, Front. Bioeng. Biotechnol. 8, Article 585363 (2020)) abbiamo raccolto esempi recenti dell’utilizzo di queste tecniche osservazionali per studiare ad esempio la proliferazione tumorale, il differenziamento cellulare e la rigenerazione di un tessuto in tessuti popolati da singole specie cellulari in vitro ed in tessuti eterogenei direttamente nell’animale nel loro stato imperturbato ed in vitalità. Infine, abbiamo dimostrato che la microscopia CARS e SHG è una valida alternativa alle tecniche istopatologiche per la caratterizzazione del differenziamento di cellule staminali in adipogenesi e condrogenesi in un ambiente 3D ingegnerizzato in vitro.

Questo risultato, ottenuto grazie ai finanziamenti del progetto NEWMED, costituisce un importante milestone per il raggiungimento dell’obiettivo 1: “Sviluppo di microscopi Raman per istopatologia intraoperatoria di lesioni tumorali”

Le vescicole lipidiche durante l’adipogenesi in cellule staminali mesenchimali è visibile in microscopia confocale a fluorescenza in verde (a) e attraverso CARS senza l’impiego di fluorofori (b). I nuclei sono visibili in ciano in (a). Allo stesso modo la condrogenesi, producendo componenti della matrice extracellulare, è visibile in fluorescenza marcando il collagene tipo I in rosso, l’actina fibrillare tipica dello scheletro cellulare in verde ed i nuclei in ciano (c), mentre in modalità label-free, attraverso la microscopia per generazione di seconda armonica SHG (d). Scale bar: 5 um

Recenti studi in vitro hanno dimostrato che la scelta della topografia e del design 3D del substrato di coltura è in grado di determinare il destino cellulare, ovvero l’espressione del fenotipo delle cellule staminali ad esso adese, attraverso specifici stimoli meccanici. Tuttavia, i meccanismi alla base della traduzione degli sforzi in segnali biochimici non sono ancora chiari. Nel lavoro di Parodi e colleghi “Characterization of mesenchymal stem cell differentiation within miniaturized 3D scaffolds through advanced microscopy techniques”, pubblicato sulla rivista International Journal of Molecular Sciences 21, 8498, 2020, abbiamo utilizzato un substrato tridimensionale, il Nichoid, per valutarne l’effetto durante il differenziamento di cellule staminali mesenchimali verso il fenotipo adipogenico e condrogenico. In questo lavoro abbiamo confrontato la microscopia confocale a fluorescenza con le tecniche nonlineari CARS ed SHG ed abbiamo dimostrato che il Nichoid stimola la produzione di grandi vescicole lipidiche ben visibili attraverso CARS e limita la condrogenesi in quanto una grande quantità di collagene è visibile esternamente alla microstruttura con SHG.

Questo risultato, ottenuto grazie ai finanziamenti del progetto NEWMED, costituisce un importante milestone per il raggiungimento dell’obiettivo 1: “Sviluppo di microscopi Raman per istopatologia intraoperatoria di lesioni tumorali”

a) Struttura chimica dei polimeri F3-PLGA e F9-PLGA. b) Immagini TEM di nanoparticelle a base di F3-PLGA (A) F9-PLGA (D), rispettivamente. La distribuzione dimensionale di nanoparticelle di F3-PLGA (B) e F9-PLGA (E) è stata confermata mediante analisi di dynamic light scattering (DLS). Spettri di 19F-NMR (400 MHz) mostrano il caratteristico segnale 19F di nanoparticelle di F3-PLGA (C) e di F9-PLGA (F).

Nella continua ricerca di sviluppare sistemi in grado di contenere allo stesso tempo funzioni diagnostiche e terapeutiche, numeri sforzi sono stati rivolti alla progettazione di sistemi ‘multifunzionali’ per il rilascio di farmaci nel trattamento di diverse patologie. Il lavoro di Metrangolo, Baldelli Bombelli, Cellesi pubblicato sulla prestigiosa rivista Chemistry A European Journal (https://doi.org/10.1002/chem.202002078) propone una nuova classe di co-polimeri fluorurati a base di acido poli lattico-co-glicolico (PLGA), un polimero biocompatibile e biodegradabile approvato dal Food and Drug Administration (FDA). In particolare, nei laboratori SupraBioNano diretti dal Professore Pierangelo Metrangolo (www.suprabionano.eu) sono stati sintetizzati e caratterizzati due nuovi composti, F3-PLGA e F9-PLGA, contenenti rispettivamente 3 e 9 atomi equivalenti di fluoro per consentire analisi di immagine molecolare mediante risonanza magnetica con fluoro 19 (19F-MRI). In Figura sono rappresentati i risultati ottenuti. Nel lavoro è stato dimostrato che i composti F-PLGA quando in soluzione acquosa formano spontaneamente nanoparticelle colloidali stabili caratterizzate da un forte segnale 19F-NMR. Inoltre, rispetto a nanoparticelle a base di PLGA non fluorurate, le nanoparticelle fluorurate hanno mostrato una maggiore capacità di incapsulare farmaci idrofobici contenenti atomi di fluoro quali il desametasone e la leflunomide. Studi preliminari in vitro su cellule umane hanno mostrato una significativa penetrazione cellulare e la capacità di rilasciare il farmaco incapsulato. Questo risultato, ottenuto grazie ai finanziamenti del progetto NEWMED, costituisce un importante passo per il raggiungimento dell’obiettivo 3 ‘Formulazione di nanovettori per il rilascio controllato di farmaci nel cuore malato’